EFFETTO CIDA

VALUTAZIONE DELL’EFFICACIA DELL’EFFETTO CIDA DI ACQUE IMPRINTATE CON “CODICI ENERGIA ANTIBIOTICI”

PREMESSA

Questo report contiene i dati sperimentali ottenuti durante l’esecuzione del test per la valutazione dell’effetto battericida in seguito a trattamento con i campioni in oggetto.

I risultati del test sono presentati sotto forma di tabelle e rappresentazioni grafiche e sono stati ottenuti seguendo le norme di Buona Pratica di Laboratorio (GLP).

Il report ed i dati in esso contenuti sono da intendere per esclusivo uso interno. Ogni forma diversa di utilizzo dovrà  essere preventivamente concordata con UB-CARE S.r.l.

INDICE

1. SOMMARIO pag. 4

   1. COMMITTENTE pag. 4

   2. CAMPIONE pag. 4

   3. TEMPISTICHE DELLO STUDIO pag. 4

   4. LABORATORIO INCARICATO pag. 5

   5. TEST ESEGUITI pag. 5

   6. SPERIMENTATORE pag. 5

   7. SUPERVISORE SCIENTIFICO pag. 5

2. SCOPO pag. 6

3. MATERIALI E METODI pag. 7

   1. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE pag. 7

   2. MICRO-ORGANISMI UTILIZZATI pag. 7

   3. DETERMINAZIONE DELLA CARICA BATTERICA pag. 8

      1. Preparazione della coltura batterica pag. 8

      2. Analisi della carica batterica tramite conta su piastra pag. 8

4. RISULTATI pag. 9

   1. VALUTAZIONE DELLA CARICA BATTERICA TRAMITE CONTA SU PIASTRA pag. 9

5. CONCLUSIONI pag. 13

6. SOMMARIO

   1. COMMITTENTE DERMING Srl

      Viale Cesare Battisti, 38 20900, Monza (MB)

   2. CAMPIONE

      A: AUG + Talita (fisio) B: AUG + Talita (dist)

      C: Complex + Talita (fisio) D: Complex + Talita (dist)

      E: Complex + Talita (idroal – dist) F: Complex + Talita (idroal – fisio) G: AUG + Talita (idroal – dist)

      H: AUG + Talita (idroal – fisio) I: Controllo (fisio)

      L: Controllo (dist)

      M: Controllo (idroal – fisio) N: Controllo (idroal – dist)

   3. TEMPISTICHE DELLO STUDIO DATA DI INIZIO TEST: 24/08/2015

      DATA DI FINE TEST: 18/09/2015

   4. LABORATORIO INCARICATO UB-CARE S.r.l.

      Spin-off accademico dell’Università  di Pavia, laboratori dell’Unità di Immunologia e Patologia generale, Dipartimento di Medicina Molecolare, Via Ferrata 9, 27100-Pavia.

   5. TEST ESEGUITI

      E’ stata analizzata la capacità  del prodotto in esame di ridurre la carica batterica del ceppo

      E. coli, tramite tecniche di microbiologia.

   6. SPERIMENTATORE Dr.ssa Sabrina Sommatis, PhD

      

   7. SUPERVISORE SCIENTIFICO Dr.ssa Paola Perucca, PhD

      

7. SCOPO

   Lo scopo del test ਠdi valutare l’eventuale capacità  del prodotto di ridurre la carica batterica in seguito a contatto con il ceppo E. coli, tramite tecniche di microbiologia, seguendo il protocollo sperimentale indicato dal cliente.

8. MATERIALI E METODI

   La metodica utilizzata è stata precedentemente concordata con il cliente, che ha approvato le modifiche apportate.

   1. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE

      I campioni sono stati trattati secondo le indicazione del committente. Gli esperimenti sono stati condotti in cieco. Solo al momento dell’elaborazione dati e stesura report è stata aperta la busta sigillata contenente i diversi gruppi di trattamento. In Tabella 3.1. sono riassunti i gruppi dei campioni utilizzati.

      	Controllo	AUG + Talita	Complex + Talita
      IDROAL-DIST	N	G	E
      DIST	L	B	D
      IDROAL-FISIO	M	H	F
      FISIO	I	A	C

      Tabella 3.1.: Gruppi di campioni testati.

   2. MICRO-ORGANISMI UTILIZZATI

      In questo saggio è stato utilizzato il ceppo batterico E. coli (ATCC 25922), come richiesto dal committente. Il terreno di coltura usato per la crescita in liquido è LB (Luria Broth); mentre per la crescita su piastra sono state utilizzate piastre con terreno TSA (Tryptone Soy Agar, HIMEDIA).

   3. DETERMINAZIONE DELLA CARICA BATTERICA

      E’ stata valutata la capacità delle soluzioni da testare di ridurre la carica batterica del ceppo E. coli in seguito a contatto per 5 h a 37°C in agitazione (200 rpm).

      1. PREPARAZIONE DELLA COLTURA BATTERICA

         Le colture batteriche sono state preparate in terreno LB (Luria Broth), utilizzando nella preparazione la stessa soluzione da misurare. Il ceppo batterico E. coli (40 μl) è stato risospeso in 200 μl di H2O sterile e da questa soluzione 50 μl sono stati aggiunti a 30 ml di terreno precedentemente preparato (sospensione batterica 1).

         Successivamente, è stata preparata la seguente miscela contenente:

         • 10 ml di sospensione batterica 1;

         • 10 ml di soluzione da analizzare;

         • 10 ml di terreno LB.

         La coltura è stata mantenuta in agitazione (200 rpm) per 5 h a 37°C.

         Lo stesso protocollo è stato seguito per tutte le soluzioni da analizzare (A-N).

      2. ANALISI DELLA CARICA BATTERICA TRAMITE CONTA SU PIASTRA

         Al termine del tempo prestabilito, sono state effettuate diluizioni scalari in modo da seminare su piastre con terreno TSA le diluizioni dei campioni pari a 10-4, 10-5 e 10-6.

9. RISULTATI

I risultati ottenuti vengono forniti in forma tabulare e grafica riportante l’attività di riduzione della carica batterica in seguito all’incubazione della sospensione di E. coli con le diverse soluzioni da analizzare.

I valori riportati rappresentano la media di almeno due esperimenti condotti in doppio. Dato il numero ridotto e la forma dei dati da analizzare è stato usato il test Kruskal-Wallis che rappresenta un metodo non parametrico di analisi, adatto per una distribuzione dei valori non-normale (non-gaussiana).

Sono stati considerati statisticamente significativi e altamente significativi i valori di p-value

inferiori o uguali a 0,05 e inferiori o uguali a 0,01.

4.1. VALUTAZIONE DELLA CARICA BATTERICA TRAMITE CONTA SU PIASTRA

La capacità di ridurre la carica batterica delle soluzioni è stata valutata mettendo a contatto il ceppo batterico E. coli con i campioni da testare.

Dopo 5 h di contatto, la sospensione batterica è stata diluita in modo da poter piastrare le diluizioni 10-4, 10-5 e 10-6. Tramite questa metodica è possibile quantificare il numero di colonie batteriche presenti nella soluzione in seguito a trattamento con il prodotto.

Si è proceduto con la conta dei soli campioni pari a 10-5-10-6 poiché la diluizione superiore risulta non contabile a causa della patina batterica cresciuta.

In Figura 4.1. e Tabella 4.1. sono riportati il numero di Unità Formanti Colonia (CFU/ml), che rappresenta la media (± deviazione standard) degli esperimenti effettuati.

Figura 4.1. Analisi dell’attività battericida delle soluzioni analizzate in seguito a contatto con una coltura di E. coli (n=2; replicati=2).

Tabella 4.1. Conta delle colonie in seguito ad incubazione della coltura batterica di E. coli con le diverse soluzioni analizzate.

Confrontando tutti i gruppi insieme, non si evidenzia una significatività statistica (p=0,21); se si confrontano invece i tre gruppi di ciascun cluster orizzontale indicati in Tabella 3.1., si può confermare una significatività (p=0,050) per quanto riguarda il gruppo delle soluzioni L-B-D, ovvero:

• L: Controllo (dist)

• B: AUG + Talita (dist)

• D: Complex + Talita (dist)

con il gruppo B che mostra un valore inferiore dell’80% rispetto al controllo (gruppo L) e al gruppo D.

Inoltre, l’analisi statistica condotta sui gruppi verticali della Tabella 3.1. mostra una differenza statisticamente significativa (p=0,034), con il gruppo B inferiore rispetto ai gruppi G, H e A rispettivamente dell’84%, 81% e 85%.

Nella Figura 4.2. sono riportate le immagini rappresentative delle piastre in cui sono stati seminati i campioni dopo il tempo di incubazione con le soluzioni e la coltura batterica E. coli. Risulta particolarmente apprezzabile la riduzione del numero di colonie, e quindi la capacità della singola soluzione presa in esame di ridurre la carica batterica, nella piastra B.

Figura 4.2. Immagini rappresentative delle piastre in cui sono stati seminati i campioni dopo il tempo di incubazione con le soluzioni e la coltura batterica E. coli.

1. CONCLUSIONI

   Dai risultati ottenuti tramite test microbiologico nelle condizioni sperimentali descritte e dal confronto tra i gruppi orizzontali della Tabella 3.1., si può osservare che:

   • N/G/E: la soluzione E ha mostrato una diminuzione della carica batterica, pur non statisticamente significativa;

   • I/A/C: la soluzione C ha mostrato una diminuzione della carica batterica, pur non statisticamente significativa;

   • M/H/F: non è stata rilevata alcuna diminuzione della carica batterica;

   • L/B/D: il gruppo B ha mostrato una riduzione statisticamente significativa del numero di colonie rispetto agli altri due gruppi.

Dal confronto tra i gruppi verticali della Tabella 3.1. emerge una diminuzione statisticamente significativa nelle colonie del campione B rispetto ai campioni G, H e A.

Pavia, 18 settembre 2015